Journal of HIV & Retro Virus Acesso livre

Abstrato

Estabelecimento de um clone virulento de cDNA completo para o Coronavírus da Síndrome Respiratória do Médio Oriente (MERS-CoV)

Zhu Long Chao

Sendo o clone infeccioso MERS-CoV uma plataforma importante para estudar a função da proteína do vírus e a interação vírus-hospedeiro. No presente estudo, o clone de cDNA infeccioso de MERS-CoV adaptado a células Vero (MERS-CoV-HKU) foi gerado com tecnologia de clone sem costura baseada no local de restrição de classe II BsmBI. O seu genoma foi dividido num painel de 12 fragmentos contíguos e após amplificação por PCR flanqueado com BsmBI. Os fragmentos foram posteriormente montados em cromossomas bacterianos artificiais (BAC) utilizando junções únicas formadas pela digestão da endonuclease BsmBI com duas rondas de clonagem. Dois locais de restrição BsmBI dentro do genoma foram removidos por mutação silenciosa e definidos como marcador molecular de icMERS-CoV-HKU. Por fim, foi recuperado um MERS-CoV-HKU completo, a jusante do promotor do CMV em BAC.

Comparando com a estirpe HCoV-EMC/2012 de tipo selvagem, o MERS-CoV-HKU recuperado por clone infeccioso apresentou títulos elevados em células Vero e Huh7. Através da análise genética, foram encontradas modificações genéticas em proteínas não estruturais (nsp2, nsp3, nsp14 e nsp16) e estruturais (Spike, ORF5 e N). As mutações sinónimas foram colocadas em nsp2 (A2169C), nsp3 (C6172T, A6954G), nsp14 (C19514T), nsp16 (T21423G), S (A22367G, T24093A) e N (T29149A). Foram encontradas mutações não sinónimas na nsp3 (C6172T, A6954G), S (C25217T) e N (A29574T), o que leva à mutação de aminoácidos na nsp3 (T198I, D1702Y), S (S1251F) e N (S192T). Surpreendentemente, foram encontradas inserções 'SHY' de três aminoácidos e deleção 'TTTA' de quatro nucleótidos na região S2 e ORF5, respetivamente.

De acordo com o estudo anterior, o RBD do BatCoV-HKU4 e do BatCoV-HKU25 pode reconhecer o recetor DPP4 humano, mas o RBD do BatCoV-HKU5 não. Para elucidar a relação entre o MERS-CoV e os BatCoVs, foram gerados o clone infeccioso MERS-CoV e os clones infecciosos quiméricos MERS-CoV em que a região MERS RBD foi substituída pela do BatCoV-HKU4, BatCoV-HKU5 e BatCoV-HKU25. Os clones infecciosos recombinantes de MERS-CoV foram ainda avaliados quanto à sua replicação nas linhas celulares Vero e Huh7.

O nosso clone infeccioso MERS-CoV recombinante demonstrou o seu papel crucial no estudo da transmissão e patogénese interespécies do coronavírus.