American Journal of Drug Delivery and Therapeutics Acesso livre

Abstrato

Expressão da Urease B do Helicobacter pylori iraniano em Apoplast Tobacco

Tabrizi Maleki

1. Antecedentes

A Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa, isolada pela primeira vez por Marshall e Warren a partir da mucosa gástrica de doentes com gastrite e úlceras pépticas. O Helicobacter pylori é a principal causa de infeção crónica da mucosa gástrica, afetando 50% da população mundial. Recentemente, foi demonstrado que o H. pylori causa outras complicações, como úlceras gástricas, inflamação duodenal e gastrite. Segundo a literatura, uma proporção considerável dos doentes infetados pelo H. pylori pode não desenvolver doenças gastroduodenais e permanecer assintomático durante um longo período. Por outro lado, as infeções de longa duração aumentam o risco de doenças como o adenocarcinoma e o linfoma gástrico.

Vários estudos confirmaram o H. pylori como um agente cancerígeno definitivo. A taxa de mortalidade, associada à infecção por Helicobacter pylori, foi estimada em 1 caso por 34 homens infectados e 1 caso por 60 mulheres infectadas. O Helicobacter pylori produz uma grande quantidade de urease (10% - 15% do peso total da proteína) que é necessária para a sobrevivência e patogénese do H. Muitas enzimas reduzem a acidez do meio imediato do H. pylori, produzindo amónia e carbonato a partir da ureia. A urease de Helicobacter pylori é uma enzima multimérica com um peso molecular de 550 kDa, que é recolhida a partir de duas subunidades separadas de UreA (29,5 kDa) e UreB (66 kDa). Recentemente, os investigadores têm-se preocupado com o desenvolvimento de vacinas contra as infecções por H. pylori. Entre vários antigénios candidatos, o UreB é considerado o mais eficaz, uma vez que a imunização de ratinhos com UreB purificada resulta numa maior imunogenicidade e proteção, ao contrário da Ureia. A selecção da urease como alvo de imunização baseia-se no facto de que as proteínas da membrana provocam frequentemente uma resposta imunitária.

Neste estudo, utilizámos um software de previsão com alto desempenho para o mapeamento de epítopos. Com vários epítopos específicos de linfócitos B, localizados perto uns dos outros, este programa selecionou o fragmento de aminoácidos do gene UreB. Além disso, o fragmento antigénico foi expresso e purificado como proteína recombinante da estirpe Escherichia coli BL21(DE3). Este estudo teve como objetivo apresentar um fragmento de UreB recombinante (rUreB) com propriedades antigénicas significativas, utilizando programas de software relevantes.

2. Objetivos

O objetivo deste estudo foi fornecer um vetor recombinante, composto pela região antigénica de UreB de H. pylori, utilizando os epítopos imunodominantes do antigénio em vez da sequência total e expressão em E. coli. Além disso, tivemos como objetivo determinar a sua antigenicidade como vacina candidata e avaliar a sua eficácia no diagnóstico serológico da infeção por H. pylori em humanos.

3. Métodos

3.1. Preparação de bactérias, plasmídeos e outros reagentes

Neste estudo, o H. pylori foi cultivado a partir de biópsia de doentes dispépticos, submetidos a endoscopia diagnóstica de rotina. Antes da biópsia, foram obtidos consentimentos informados de todos os doentes para a participação no estudo. As condições de cultura foram determinadas com base nas conclusões de relatórios anteriores. Os espécimes de biópsia isolados foram cultivados em ágar Brucella (Merck, Alemanha), contendo trimetoprim (5 µg/mL), vancomicina (10 µg/mL) e anfotericina B (2,5 µg/mL), suplementados com 5% de sangue de ovelha.

Após incubação em condições microaerofílicas durante 3 - 5 dias a 37°C (CO2: 10%), as bactérias cultivadas foram identificadas como H. pylori através de testes microbiológicos de rotina, incluindo coloração de Gram, bem como testes de oxidase, urease e catalase. Para avaliação adicional, utilizámos os vetores pET-32a e pBSK (Novagen Inc., EUA). Além disso, o vector pET-32a foi utilizado para produzir proteínas de fusão com um marcador de 6-histidina e um marcador de epítopo T7 N-terminal. Estes aminoácidos adicionais aumentaram o peso da proteína produzida até 20 kDa. Neste estudo, as enzimas de restrição e a DNA ligase foram adquiridas à Fermentas (Lituânia), e a estirpe E. coli DH5α (Stratagene, EUA) foi utilizada para a clonagem inicial. Além disso, o pET-32a recombinante (pET-32a UreB) foi transformado em E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen, EUA) como estirpe hospedeira de bactérias. Para a cultura bacteriana de rotina, utilizou-se o caldo Lysogeny (caldo Luria-Bertani, LB; Sigma, EUA). Os antibióticos necessários, incluindo ampicilina (100 µg/mL) e cloranfenicol (34 µg/mL; Sigma, EUA), foram adicionados ao meio LB (10). Os produtos químicos foram adquiridos à Merck (Alemanha) e as enzimas foram obtidas à Fermentas (Lituânia) e à SinaClon Co.

Resultados: Os resultados da sequenciação da PCR foram indicativos de clonagem do gene UreB no plasmídeo recombinante. A produção da proteína foi induzida pelo isopropil β-D tiogalactopiranosídeo (IPTG), e a proteína expressa foi purificada via diálise, utilizando o kit Ni-NTA. Além disso, a proteína recombinante com um peso molecular de 42 kDa foi reconhecida por anticorpos em Western blotting.

Conclusão: A avaliação de anticorpos foi indicativa de elevadas propriedades antigénicas para o fragmento imunogénico, previstas pela bioinformática imunológica. Assim sendo, a proteína recombinante UreB pode ser um antigénio adequado para o desenvolvimento de vacinas contra o H. pylori e outros kits de diagnóstico.